Как был открыт метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Кэри Б. Мюллис лауреат Нобелевской премии в области химии

Этот удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве копий был придуман при необычных обстоятельствах.

Теперь его называют полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 млрд. сходных по структуре молекул. Эта реакция очень проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла.

 Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте.

Полимеразная цепная реакция значительно облегчила работу молекулярных биологов - с ее помощью они могут получать сколь угодно большие количества специфической ДНК. На первый взгляд может показаться, что ДНК получить очень просто.

 В действительности выделить специфический тип молекул нативной ДНК из любого организма, за исключением чрезвычайно простых вирусов, - задача не из легких..

Молекула ДНК состоит из двух цепей, построенных из нуклеотидов: дезокиаденилатов (А), дезоксигуанилатов (G), дезокситимидилатов (Т) и дезоксицитидилатов (С). Последовательность нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности другой: а располагаются всегда против T, а G против С. Благодаря комплементарности цепи удерживаются вместе. У каждой цепи есть 3` конец и 5` конец. Поскольку ориентации двух цепей противоположны, говорят, что оно антипараллельны.

Трудности обусловлены самой природой молекул ДНК. Они представляют собой хрупкие цепи, построенные из четырех типов дезоксирибонуклеотидов: дезоксиаденилата (А), дезокситимидилата (Т), дезоксигуанилата (G) и дезоксицитидилата (С); в последовательности этих оснований закодирована генетическая информация.

Одиночные цепи ДНК встречаются редко, обычно пары цепей с комплементарными последовательностями образуют двойные спирали, в которых остатки А в одной цепи связываются с остатками Т в другой, а остатки G связываются с остатками С (см. рисунок нас. 27).

В клетках молекулы ДНК окружены белками, которые обеспечивают ее более плотное свертывание. Как правило, не удается выделить ДНК из клеток неповрежденной - нить оказывается разорванной в случайно расположенных точках.

Поэтому, если ДНК выделяется из 1000 идентичных клеток, препарат будет содержать 1000 копий каждого гена, однако все эти копии окажутся во фрагментах разной длины.

В течение длительного времени эта проблема затрудняла изучение генов. Наконец, в 70-х годах были открыты ферменты - рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), которые расщепляют ДНК в специфических точках.

 Исследователи получили возможность "разрезать" ДНК на более короткие и более стабильные фрагменты, которые просто идентифицировать. При этом легче выделять и изучать фрагменты ДНК с находящимися в них генами.

К концу 70-х годов молекулярные биологи энергично взялись за изучение ДНК с помощью эндонуклеаз и других молекул, называемых олигонуклеотидными пробами (зондами). Олигонуклеотид представляет собой короткую цепь нуклеотидов, расположенных в специфической последовательности.

В определенных условиях олигонуклеотид специфически связывается с комплементарной последовательностью нуклеотидов в одноцепочечной ДНК. Поэтому искусственно синтезированные радиоактивные олигонуклеотиды могут служить "пробами", когда необходимо определить, содержит ли препарат ДНК специфическую последовательность нуклеотидов или ген.

К 1983 г. синтез олигонуклеотидов стал утрачивать свою привлекательность для химиков. Этот трудоемкий процесс - своего рода искусство - стала вытеснять более надежная технология с применением автоматических устройств. Это было огромным достижением.

В результате этой минипромышленной революции у химиков, синтезирующих олигонуклеотиды, работы стало гораздо меньше. Автоматические синтезаторы, которые  стали использовать, позволяли получать даже больше олигонуклеотидов, чем помещалось в холодильниках, и заведомо больше, чем могли использовать в своих опытах молекулярные биологи.  

Важно разработать простой метод идентификации нуклеотида в заданном положении в молекуле ДНК, особенно для ДНК высокой сложности (например, ДНК человека) -  который называют секвенированием с использованием дидезоксинуклеотидов.

Концы цепи ДНК химически различны, один обозначается как 5', другой - как 3 '. В двойной спирали ДНК комплементарные цепи антипараллельны, следовательно, 3'-конец одной цепи связан с 5 '-концом другой, и наоборот.

В 1955 г. А. Корнберг и его коллеги из Станфордского университета открыли в клетках фермент, который назвали ДНК-полимеразой. ДНК-полимеразы выполняют ряд функций, в том числе обеспечивают репарацию и репликацию ДНК.

Эти ферменты способны удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был гибридизован, т. е. связан с комплементарной цепью ДНК, которая называется матрицей.

Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (они используются в качестве строительных блоков).

Нуклеотид, который присоединяет ДНК-полимераза, комплементарен основанию в соответствующем положении матричной цепи.

 Например, если это А, полимераза присоединяет Т, если матричный нуклеотид - G, то фермент присоединяет С. Многократно повторяя эту реакцию, полимераза способна удлинять 3'-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5 ' -конца матрицы (см. рисунок на с. 29).

В ходе репарации и репликации двойной спирали ДНК каждая цепь служит матрицей для синтеза другой цепи.

Остановимся теперь на методе секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов, который обычно называют методом Сэнгера, по имени одного из его создателей - Ф. Сэнгера из Лаборатории молекулярной биологии Британского совета медицинских исследований. Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК он использовал ДНК-полимеразу, матричную ДНК, нуклеозидтифосфаты, а также специальные дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTP).

 Подобно обычным нуклеотидам, ddNTP могут быть присоединены к концу растущей цепи с помощью ДНК-полимеразы, однако ddNTP при этом блокирует 3 ' -конец, полностью предотвращая дальнейшее наращивание цепи. В реакции Сэнгера можно получить праймеры, удлиненные в разной степени, а затем блокированные ddNTP.

Зная, какой из ddNTP был присоединен, и определив длину синтезированных фрагментов ДНК, можно установить последовательность нуклеотидов в матричной цепи.

Например, если в данном положении был присоединен дидезоксиаденозин (ddA), соответствующим комплементарным основанием в матрице должен быть Т, а присоединение дидезоксигуанозина (dclG) означает присутствие в матрице С.

Нужно было модифицировать этот метод и использовать только полимеразу, матрицу, ddNTP и праймер, т. е. исключить из смеси обычный нуклеозидтрифосфаты.

Поэтому наращивание праймеров должно было завершиться сразу после включения первого же ddNTP в цепь..

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ - это простой лабораторный метод копирования фрагмента ДНК с использованием легко доступных реактивов. Поскольку число копий возрастает экспоненциально, всего за несколько часов можно получить более 100 млрд. копий.

Существуют довольно веские причины, по которым подобный метод определения последовательности нуклеотидов непригоден. Трудность заключалась в том, что иногда олигонуклеотиды гибридизуются не с теми последовательностями ДНК, для выявления которых они синтезированы; подобное неспецифическое связывание неизбежно привело бы к неоднозначности результатов.

 Даже наиболее искусным экспериментаторам не удавалось достичь связывания олигонуклеотидов с суммарной ДНК человека со специфичностью, которая позволяла бы получать осмысленные результаты.

Именно из-за этих ограничений исследователи были вынуждены применять для изучения ДНК человека более сложные методы. Например, для разрезания ДНК могут быть использованы ферменты рестрикции, затем полученные фрагменты (рестрикты) можно разделить с помощью электрофореза. Таким способом добиваются некоторой "очистки" искомой последовательности ДНК от общей ДНК перед гибридизацией с олигонуклеотидными пробами.

Благодаря этой процедуре уменьшается вероятность случайной гибридизации и соответственно увеличивается вероятность получения значимых результатов. Однако удается она далеко не всегда и, кроме того, занимает много времени и не позволяет работать с де-градированной или денатурированной ДНК.

Другой подход, значительно более трудоемкий для рутинного анализа, основан на клонировании. Изучаемую последовательность нуклеотидов ДНК человека можно клонировать, или копировать, встроив ее в небольшую кольцевую ДНК, которая называется плазмидой.

 Затем, размножая бактериальные клетки, несущие эту плазмиду, можно получить большое количество исследуемой ДНК. Чтобы определить ее последовательность, проводят гибридизацию с олигонуклеотидом и секвенирование с использованием дидезоксинуклеотидов.

С помощью такого подхода в начале 80-х годов была получена большая часть данных о последовательностях ДНК человека.

Группа под руководством Г. Эрлиха, одного из ведущих специалистов фирмы Cetus, пыталась осуществить другой подход, также основанный на гибридизации одного олигонуклеотида со специфической последовательностью ДНК человека.

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА - это фермент, способный наращивать короткие цепочки ДНК, так называемые олигонуклеотидные праймеры, если эти короткие цепочки связаны с более длинной "матричной" цепью ДНК. При этом полимераза присоединяет к 3'-концу связанного праймера соответствующий комплементарный нуклеотид. Однако если добавить дидезоксинуклеотидтрифосфат (ddNTP), например дидезоксиаденозин (ddA), дальнейший рост цепи будет невозможен, поскольку к 3'-концу ddA нуклеотиды присоединяться уже не могут.

Прежде всего нужно было разделить  цепи ДНК нагреванием, затем провести  гибридизацию олигонуклеотида с комплементарной последовательностью в одной из этих цепей. Эту смесь ДНК разделить  на четыре пробирки. В каждой пробирке будут присутствовать все четыре типа ddNTP, но только один из них будет помечен радиоактивным изотопом.

Затем добавить  ДНК-полимеразу, которая удлинит связанный с ДНК олигонуклеотид в каждой пробирке на один ddNTP. С помощью электрофореза можно отделить удлиненные олигонуклеотиды от оставшихся ddNTP. Определив, какой из радиоактивных ddNTP присоединился к олигонуклеотиду, можно будет установить, какой нуклеотид располагается в соответствующем положении в цепи ДНК.

Если вместо одного олигонуклеотида использовать два, такое определение будет гораздо точнее. Два праймера будут расположены с обеих сторон от пары нуклеотидов, которую нужно  идентифицировать.

Если синтезировать олигонуклеотиды разного размера, их можно будет отличить друг от друга. Если олигонуклеотиды будут комплементарны разным цепям ДНК, можно будет определить соответствующие последовательности в обеих цепях молекулы. Это позволит без дополнительных сложностей осуществлять внутренний контроль.

ЧТОБЫ ИДЕНТИФИЦИРОВАТЬ пару оснований в определенном положении фрагмента ДНК, автор статьи надеялся использовать вариацию метода секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов. Сначала два праймера должны были связаться с противоположными цепя праймеру мог присоединиться всего один нуклеотид. Идентифицировав присоединившиеся ddNTP, можно установить, какая пара нуклеотидов расположена между праймерами. Метод можно использовать с одним праймером, но применение двух праймеров обеспечивает контроль для подтверждения результатов. Планируя этот эксперимент, автор пришел к идее полимеразной цепной реакции.

Препараты ДНК могут содержать следовые примеси нуклеозидтрифосфатов. Если эти случайные нуклеотиды будут присоединяться к 3'-концам праймеров до того, как произойдет присоединение меченых ddNTP, интерпретировать результаты электрофореза окажется непросто.

Свободные нуклеозидтрифосфаты в пробе можно разрушить с помощью щелочной фосфатазы - бактериального фермента. Этот фермент отщепит от нуклеозидтрифосфатов необходимые для реакции остатки фосфата, предотвратив их участие в реакции полимеризации.

Однако после этого придется каким то способом удалить фосфатазу из реакционной смеси, иначе она разрушит ddNTP, которые я добавлю. Обычно ферменты, активность которых нежелательна, можно инактивировать нагреванием пробы; при этом нарушается форма молекул фермента, важная для его функционирования действия. Однако молекулы бактериальной щелочной фосфатазы после нагревания способны восстанавливать исходную форму.

Щелочную фосфатазу можно необратимо денатурировать, если полностью удалить из раствора ионы цинка и прогреть пробу.  Если сначала провести своего рода имитацию реакции в присутствии олигонуклеотидных праймеров и ДНК-полимеразы, но без ddNTP, то можно без труда удалить свободные нуклеозидтрифосфаты, которые присоединятся к удлиняющимся олигонуклеотидам.

Затем, повысив температуру реакционной смеси, я смогу отделить удлиненные олигонуклеотиды от матрицы ДНК. Однако при этом олигонуклеотиды с наращенными концами останутся в пробе, но таких праймеров будет намного меньше, чем исходных неудлиненных, поэтому, когда температура смеси снизится, с ДНК  будут связываться преимущественно неудлиненные праймеры. Затем можно добавить ddNTP и новую порцию ДНК-полимеразы уже для проведения самого эксперимента по секвенированию.

Цепи ДНК в исходной матрице и в удлиненном олигонуклеотиде по последовательности нуклеотидов будут идентичны. В итоге в реакции имитации число ДНК-матриц для секвенирования удвоится!

После нескольких циклов, состоящих из наращивания праймеров, отделения продуктов полимеризации, связывания новых праймеров и их наращивания, длина экспоненциально накапливающихся цепей ДНК окажется фиксированной, поскольку их концы будут точно определяться 5'-концами олигонуклеотидных праймеров. Если синтезировать праймеры, связывающиеся с более удаленными друг от друга участками ДНК, можно реплицировать в исходном препарате фрагменты ДНК большей длины. Продуктами реакции всегда будут фрагменты ДНК строго определенной длины.

Полезными оказались некоторые ранние работы Корнберга, посвященные ДНК-полимеразе. Для проведения опыта в качестве ДНК-матрицы я выбрал участок плазмидной ДНК длиной 25 нуклеотидных пар и два олигонуклеотида длиной соответственно 11 и 13 нуклеотидов.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ - это циклический процесс; в каждом цикле число молекул ДНК мишени разделяются при нагревании, потом при охлаждении с ними связываются праймеры. Затем ДНК-полимераза наращивает праймеры, присоединяя к ним нуклеотиды. В результате образуются копии цепей исходной ДНК мишени.

Были получены  из лаборатории Г. Эрлиха немного ДНК человека и была проведена  амплификацию фрагмента, содержащего ген, присутствующий в геноме человека в количестве одной копии.

Праймеры обычно имеют длину 20-30 нуклеотидов. Одно из наиболее значительных усовершенствований процесса заключается в использовании особой ДНК-полимеразы, которая первоначально была выделена из бактерии Thermus aquaticus, живущей в горячих источниках.

 Полимераза, которую  использовали в первых экспериментах, легко инактивировалась при нагревании, поэтому в каждом цикле реакции приходилось добавлять новую порцию фермента. Однако ДНК-полимераза Т. aquaticus стабильна и активна при высоких температурах, поэтому ее можно добавлять только один раз в начале реакции.

В настоящее время эту термостабильную ДНК-полимеразу выделяют из штамма бактерий, специально сконструированного методами генной инженерии.

 


Лекция добавлена 12.07.2012 в 04:59:31